辅助生殖技术及自然妊娠绒毛中印记基因PEG1甲基

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　　用于不孕症的治疗仅30余年,尚缺乏对ART了代生长发育的长期随访和系统评估,近期不少的临床报道认为ART出生儿表观遗传缺陷风险有所增加,因其绝对发病率较低,尚不能得出最终结论。ART可能影响表遗传的调控,特别是印记基因的表达,从而影响胚胎植入、胎盘形成、器官形成和胎儿生长等方面。早期自然流产约占伞部认识的15.20%,其发生体王见了人类优胜劣汰的一种自我选择方式,减少了畸形儿的出生。部分研究认为,基因印记缺陷影响了早期妊娠的维持。本文采用两利,不同的***化检测方法,对经ART技术获得妊娠的早期停育绒毛、早孕减胎绒毛及自然受孕早期停育绒毛和自然受孕早孕绒毛中PEGl的***化状态进行对比,探讨辅助生殖技术对表观遗传学的影响及印记基因疾病之间可能存在的关系,为进一步评估ART技术的安全性提供依据第一部分应用COBRA对ART早期妊娠绒毛组织中PEGl***化状态的研究【研究目的】binedBisulfiteRestriction中文摘要Analysis,COBRA),检测ART妊娠早孕绒毛及停育绒毛中印记基因PEGl的***化状态,并与自然受孕早孕绒毛及停育绒毛进行对照,探讨辅助生殖技术对印记基因PEGl***化状态的影响,及印记基因PEGl***化状态与早期妊娠胚胎发育的关系。【材料和方法】于2008年5月至2010年1月南方医院妇产科门诊收集ART早期停育绒毛31例;自然受孕早期停育绒毛29例;自然受孕早孕绒毛标本24例;同期于南方医院生殖医学中心收集ART早孕减胎绒毛12例。绒毛标本均为孕6.10周,患者年龄在21.40岁。自然停育患者双方染色体未见异常,无解剖学方面因素,无家族遗传病史。早期停育组病人B超检查提示:胚胎停止发育或停经6周后多次超声提示未见胚芽。无菌状态下收集绒毛标本,提取伞基因组DNA。将绒毛基因组DNA行重亚硫酸氢盐处理。将转化后DNA模板行PE01扩增,引物序列:(Forward,F)5’.TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTYGGTT-3’及(Reverse,R)5'-AACTC.3’。扩增产物在凝胶电泳中检测,不存在非特异性条带的情况下,将PCR产物使用限制性内切酶Taql于65。C巾反应3.3.5h。酶切产物行4%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后于凝胶成像系统中观察结果并 像,并采用labworks4.6图像捕获/分析软件行***化的定量分析。采用SPSSl3.0软件进行统计学分析。数据用均数士标准差(z+S)表示。组间数量资料比较采用One.wayANOVA两组间率的比较采用阴格表#检验。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。【结果】所有检测标本中未出现PEGI完全***化(100%)或非***化(0%)的情况。ART停育组PEGl***化程度波动于39.3.83.7%之间,ART早孕组波动于43.4.56%,自然受孕停育组为38.9.75.4%及自然受孕早孕组42.1.58.3%之间。四硕士学位论文组绒毛标本的PEGl***化程度不存在统计学差异(P=O.550)。定义自然受孕早孕组的***化状态(Z-4-2S)为正常***化范围(39.0.59.0%),比较ART停育组及自然停育组的***化异常是否存在差异。其中,ART停育组中7例标本处于异常范围(22.6%),自然停育组同样存在7例的异常(24.1%),两组之间无统计学差异(P=0.887)。【结论】ART技术获得的正常早期妊娠,早期停育及自然受孕早期妊娠、早期停育绒毛均未发现印记基因PEGl存在极端***化(100%)或非***化(O%)的状况。极端的印记异常可能早在着床前期就影响了胚胎的继续发育,导致了胚胎着床的失败而无法发育至妊娠阶段。考由于COBRA方法只对单个CpG位点进行了研究,其检测的阴性结果并不能完伞排除PEGlDNA发生***化的可能性。确应考虑同时采用其它***化检测方法进行进一步定量研究。第二部分应用焦磷酸测序定量分析ART早期妊娠绒毛组织中印记基因PEGl***化状态【研究目的】采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing),对ART妊娠早孕绒毛及停育绒毛中印记基因PEGl***化状态进行定量分析,并与自然受孕早孕绒毛及停育绒毛进行对照,弥补第一部分中Taql酶切单个位点的不足;检测亚硫酸盐的转化效率。探讨辅助生殖技术对印记基因PEGl***化状态的影响,及印记基因PEGI***化状态与早期妊娠胚胎发育的关系。【材料和方法】研究对象及绒毛标本处理、DNA提取、基因组DNA重亚硫酸修饰均同第一部分。将修饰后DNA行PEGl扩增,引物序列:(Forward,F)5’.TYGTTGTTGGTA中文摘要GTTTGTAYGGTT-3’及(Reverse,R)Biotin一5'-AACTC.3’,焦磷酸测序引物:5'-GAGGGGGTGTGGTTG。3’。PCR反应需将引物耗尽,且电泳验证不存在非目的条带,无引物二聚体。试样处理,分离DNA单链,采用瑞典Bitoage公司的PSQ96MA行测序反应。取四个检测CpG位点之C/T平均值作为该样本的***化值。两个转化位点之平均值为转化效率。并使用转化率对检测***化值进行校正。使用精子标本(理论完全非***化样本)、卵子标本(理论完伞***化标本)检测仪器测序效果。用SPSSl3.0软件统计数据。数据用均数士标准差(ziS)及。各组间数量资料比较采用Welch近似方差分析;应用ROC曲线评价了***化程度对自然流产发生的预测价值。设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。【结果】l、实验使用精子标本(PEGl理论***化值0%)、卵子标本(PEGl理论***化值100%)作为对照检测测序效果。所检测精了及卵了标本PEGl***化值与标本理论值相符合。焦磷酸测序技术测定效果准确可靠。2、亚硫酸盐转化效率波动于89.9.100%;对转化率低于95%的标本采用以下公式进行了校正:实际***化值=检测***化值.(95.转化率)。在所有绒毛标本中,PEGl***化程度波动于42.0.85.3%之间,未出现完伞***化(100%)或完全非***化(O%)的极端情况。网组问白,JPEGl***化程度存在统计学差异(尸_0.030),自然早孕组***化程度低于自然停育及ART停育组。焦磷酸测序技术对***化值测定的敏感性要优于COBRA方法。3、不同受精方式(IVFVSICSI)来源绒毛组织不存在PEGl***化值差异。4、将所有标本分为自然流产与正常早孕两组,绘制***化值与流产关系的ROC曲线。ROC曲线下面积为0.684(95%可信区间0.577.0.791),曲线下面积标准误为0.055,P=0.003。绒毛组织巾PEGl***化程度越高,自然流产发生的风险也就越高。IV核型对绒毛组织中印记基因***化状态的影响。【材料和方法】2008年5月~2010年1月间于南方医院妇产科门诊因胚胎停育而行清宫术的患者26ff0,无菌收集其绒毛组织,送南方医院遗传室行绒毛染色体核型分析,并对该部分绒毛行焦磷酸测序定

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